分子實驗介紹——印跡（Western blot）檢測

通過SDS-PAGE凝膠將細胞或生物樣品內的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如纖維素薄膜或PVDF膜）上，pcr引物設計，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的起反應，再與酶或同位素標記的第二起反應（目前主要用HRP標記的第二），經(jīng)過底物顯色或自顯影以檢測電泳分離的特異性目的***表達的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應發(fā)出熒光，通過儀器或者膠片顯色）。該技術廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

實驗流程：細胞收集-細胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質轉膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照

結果示例：

圖 A不同大小的質粒轉染細胞后，Western blot檢測圖片；B A蛋白不同培養(yǎng)時間后Western blot檢測圖片；C 使用Image pro plus軟件對A蛋白灰度檢測，A蛋白表達變化統(tǒng)計圖

RNA提取處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強的物，須在通風櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，pcr，在通風柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。

RNA pull down 檢測

RNA   pull down：RNA沉淀檢測，dna檢測，是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗方法之一。使用體外轉錄將RNA進行生物素標記，***檢測多少錢，并與細胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復合物。復合物通過磁珠結合后分離，復合物純化洗脫后通過Western blot驗證檢測特性的蛋白。若篩選可能結合的蛋白通過質譜實驗進行檢測篩選。

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